BRUCELÓZA
1.
IDENTIFIKÁCIA PÔVODCU
Preukázanie pomocou imunošpecifického ofarbenia alebo upraveného ofarbenia odolného proti kyselinám organizmov brucella morfológie v materiáli z potratov, vaginálnych výtokoch alebo v mlieku, zabezpečuje predbežný dôkaz o brucelóze, najmä ak ho podporia sérologické testy.
Po izolácií by sa mali identifikovať druhy a biovary podľa testov na fágovú lýzu a/alebo testov oxidačného metabolizmu, kritérií kultivačných, biochemických a sérologických.
Použité techniky a médiá, ich štandardizácia a interpretácia výsledkov musia vyhovovať technikám a médiám uvedených v OIE Príručke štandardov pre diagnostické testy a vakcíny, štvrté vydanie, 2000, v kapitole 2.3.1 (brucelóza hovädzieho dobytka), kapitole 2.4.2 (brucelóza kôz a oviec) a v kapitole 2.6.2 (brucelóza ošípaných).
2.1.1.
Brucella abortus biovar 1 Weybridge kmeň č. 99 alebo USDA kmeň 1119-3 sa musia použiť pri príprave všetkých antigénov použitých pri teste s použitím bengálskej červenej (rose bengal test - RBT), aglutinačnom teste séra (serum agglutination test - SAT), komplement fixačnom teste (complement fixation test - CFT) a krúžkovej mliečnej skúške (milk ring test - MRT).
2.1.2.
Štandardným referenčným sérom pre testy RBT, SAT, CFT a MRT je OIE medzinárodné štandardné referenčné sérum (OIEISS) pôvodne nazývané WHO druhé medzinárodné anti-Brucella abortus sérum (ISAbS).
2.1.3.
Štandardné referenčné séra pre ELISA testy sú:
- OIEISS,
- slabo pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISAWPSS),
- silno pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISASPSS),
- negatívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISANSS),
2.1.4.
Uvedené štandardné séra sú dostupné v Agentúre veterinárnych laboratórií (Veterinary Laboratories Agency - VLA), Weybridge, Spojené kráľovstvo.
2.1.5.
OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS a OIEELISANSS sú medzinárodnými primárnymi štandardmi, od ktorých sa musia pre každý test v každom členskom štáte alebo Slovenskej republike zriadiť sekundárne referenčné národné štandardy („pracovné štandardy“).
2.2.
Imunoenzymatické analýzy (Enzyme-linked immunosorbent assays - ELISAs) alebo iné viažuce analýzy na detekciu brucelózy hovädzieho dobytka v sére alebo mlieku.
2.2.1.
Materiál a reagenty
Použitá technika a interpretácia výsledkov sa musia validovať v súlade s princípmi ustanovenými v kapitole 1.1.3 OIE Príručky štandardov pre diagnostické testy a vakcíny, štvrté vydanie, 2000 a minimálne by mali zahrnúť laboratórne a diagnostické štúdie.
2.2.2.
Štandardizácia testu
2.2.2.1.
Štandardizácia postupu testu pre jednotlivé vzorky séra:
(a)
roztok OIEISS v pomere 1/150 alebo roztok OIEELISAWPSS v pomere 1/2, alebo roztok OIEELISASPSS v pomere 1/16 vytvorený v negatívnom sére (alebo v negatívnom združení sér) by mal podať pozitívnu reakciu,
(a)
roztok OIEISS v pomere 1/600 alebo roztok OIEELISAWPSS v pomere 1/8 alebo roztok OIEELISASPSS v pomere 1/64 vytvorený v negatívnom sére (alebo v negatívnom združení sér) by mal podať negatívnu reakciu,
(b)
OIEELISANSS by vždy malo podať negatívnu reakciu.
2.2.2.2.
Štandardizácia postupu testu pre zozbierané vzorky séra:
(a)
roztok OIEISS v pomere 1/150 alebo roztok OIEELISAWPSS v pomere 1/2 alebo roztok OIEELISASPSS v pomere 1/16 vytvorený v negatívnom sére (alebo v negatívnom združení sér) a znovu rozpustený v negatívnych sérach prostredníctvom niekoľkých vzoriek, ktoré tvoria združenie, by mal podať pozitívnu reakciu,
(c)
OIEELISANSS by vždy malo podať negatívnu reakciu,
(c)
test musí byť vhodný na detekciu dôkazu o infekcii u jedného zvieraťa zo skupiny zvierat, od ktorých sa odobrali vzorky séra.
2.2.2.3.
Štandardizácia postupu testu pre bazénové vzorky mlieka alebo srvátky:
(a)
roztok OIEISS v pomere 1/1000 alebo roztok OIEELISAWPSS 1/16 v pomere alebo roztok OIEELISASPSS v pomere 1/125 vytvorený v negatívnom sére (alebo v negatívnom združení sér) a znovu rozpustený v pomere 1/10 v negatívnom mlieku by mal podať negatívnu reakciu,
(b)
OIEELISANSS rozpustený v pomere 1/10 v negatívnom mlieku by mal vždy podať negatívnu reakciu,
(c)
test musí byť vhodný na detekciu dôkazu o infekcii u jedného zvieraťa zo skupiny zvierat, od ktorých sa vzorky mlieka alebo srvátky zozbierali.
2.2.3.
Podmienky na použitie testov ELISAs na diagnózu brucelózy hovädzieho dobytka:
2.2.3.1.
Pri použití uvedených kalibračných podmienok pre ELISAs pri vzorkách séra sa diagnostická senzitivita testu ELISA bude rovnať alebo bude väčšia ako test RBT alebo CFT, pričom sa zohľadní epidemiologická situácia, za ktorej sa ELISA uplatňuje.
2.2.3.2.
Pri použití uvedených kalibračných podmienok pre ELISAs pri bazénových vzorkách mlieka sa diagnostická senzitivita testu ELISA bude rovnať alebo bude väčšia ako test MRT, pričom sa nezohľadní len epidemiologická situácia, ale tiež priemerné a očakávané extrémne chovateľské systémy.
2.2.3.3.
Ak sa ELISAs použijú na certifikačné účely v súlade s
§ 6 ods. 1 alebo na zriadenie a udržanie štatútu chovu v súlade s
prílohou č. 2 časťou II ods. 10, zber vzoriek séra sa musí vykonať tak, aby sa výsledky testov mohli bezpochyby pripísať k jednotlivým zvieratám zaradeným do zberu. Na vzorkách séra odobratých z jednotlivých zvierat sa musí vykonať akýkoľvek potvrdzujúci test.
2.2.3.4.
ELISAs možno použiť na vzorke mlieka odobratej z mlieka odobratého z farmy s minimálne 30 % dojných kráv. Ak sa použije táto metóda, musia sa prijať opatrenia, aby sa zabezpečilo, že vzorky odobraté na skúmanie, možno bezpochyby spojiť s jednotlivými zvieratami, od ktorých sa mlieko odobralo. Na vzorkách séra odobratých z jednotlivých zvierat sa musí vykonať akýkoľvek potvrdzujúci test.
2.3.
Komplement fixačný test (CFT)
2.3.1.
Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu v slanom roztoku s fenolom [NaCl 0,85 % (m/v) a fenole pri 0,5 % (v/v)] alebo vo veronálnom pufri. Antigény možno doručiť v koncentrovanom stave za predpokladu, že nálepka na fľaši uvádza použitie riediaceho faktora. Antigén sa musí skladovať pri teplote 4 oC a nesmie sa zmraziť.
2.3.2.
Séra sa musia inaktivovať takto:
- bovinné sérum: 56 až 60 oC na 30 až 50 minút,
- sérum ošípaných: 60 oC na 30 až 50 minút.
2.3.3.
Aby počas postupu testu nastala autentická reakcia, dávka komplementu by mala byť vyššia ako minimum potrebné na úplnú hemolýzu.
2.3.4.
Nasledovné kontroly sa vykonajú pri každom vykonaní komplement fixačného testu:
(a)
kontrola anti-komplementárneho účinku séra,
(c)
kontrola senzibilizovaných červených krviniek,
(e)
kontrola s použitím pozitívneho séra senzitivity na začiatku reakcie,
(f)
kontrola špecifity reakcie s použitím negatívneho séra.
2.3.5.
Výpočet výsledkov
OIEISS obsahuje 1 000 medzinárodných CFT jednotiek (ICFTU) na ml. Ak sa OIEISS testuje daným spôsobom, výsledok sa udá v titroch (TOIEISS). Výsledky testu na testované sérum udané v titroch (TTESTSERUM) sa musia vyjadriť v ICFTU na ml. Pri prevádzaní titra na ICFTU faktor (F) potrebný na prevedenie titra neznámeho testovaného séra (TTESTSERUM) otestovaného prostredníctvom tejto metódy na ICFTU možno zistiť z tohto vzorca:
F = 1 000 x 1/TOIEISS
a obsah medzinárodných CFT jednotiek na ml testovaného séra (ICFTESTSERUM) z tohto vzorca:
IKBRETESTSERUM = F x TTESTSERUM
2.3.6.
Interpretácia výsledkov
Sérum obsahujúce 20 alebo viac ICFTU na ml sa považuje za pozitívne.
2.4.
Krúžková mliečna skúška (MRT)
2.4.1.
Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu v slanom roztoku s fenolom [NaCl 0,85 % (m/v) a fenole pri 0,5 % (v/v)] ofarbenom hematoxylínom. Antigén sa musí skladovať pri teplote 4 oC a nesmie sa zmraziť.
2.4.2.
Senzitivita antigénu sa musí štandardizovať v spojení s OIEISS tak, aby antigén vyprodukoval pozitívnu reakciu s roztokom OIEISS v pomere 1/500 v negatívnom mlieku, zatiaľ čo roztok v pomere 1/1000 by mal byť negatívny.
2.4.3.
Krúžková skúška sa musí vykonať na vzorkách, ktoré predstavujú obsah každej kanvy mlieka alebo obsah každého mliečneho tanku z farmy.
2.4.4.
Mliečne vzorky sa nesmú zmraziť, ohriať alebo podrobiť prudkému trepaniu.
2.4.5.
Reakcia sa musí vykonať pri použití jednej z týchto metód:
- na stĺpci mlieka minimálnej výšky 25 mm a na objeme mlieka 1 ml, do ktorého sa pridalo buď 0,03 ml alebo 0,05 ml z jedného zo štandardizovaných ofarbených antigénov,
- na stĺpci mlieka pri minimálnej výške 25 mm a na objeme mlieka 2 ml, do ktorého sa pridalo 0,05 ml z jedného zo štandardizovaných ofarbených antigénov,
- na objeme mlieka 8 ml, do ktorého sa pridalo 0,08 ml z jedného zo štandardizovaných ofarbených antigénov.
2.4.6.
Zmes mlieka a antigénov sa musí inkubovať pri teplote 37 oC počas 60 minút spolu s pozitívnymi a negatívnymi pracovnými štandardmi. Následná 16- až 24-hodinová inkubácia pri teplote 4 oC zvýši senzitivitu testu.
2.4.7.
Interpretácia výsledkov:
(a)
negatívna reakcia: zafarbené mlieko, smotana bez farby,
(b)
pozitívna reakcia:
- rovnako zafarbené mlieko a smotana alebo
- mlieko bez farby a zafarbená smotana.
2.5.
Test s použitím bengálskej červenej (RBT)
2.5.1.
Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu v pufrovanom zrieďovadle brucella antigénu pri 3,65 ± 0,05 pH, ofarbenom s použitím farby bengálskej červenej. Antigén sa doručí pripravený na použitie a musí sa skladovať pri teplote 4 oC a nesmie sa zmraziť.
2.5.2.
Antigén sa pripraví bez odkazu na koncentráciu buniek, ale jeho senzitivita sa musí štandardizovať v spojení s OIEISS tak, aby antigén vyprodukoval pozitívnu reakciu so sérovým roztokom v pomere 1/45 a negatívnu reakciu s roztokom v pomere 1/55.
2.5.3.
RBT sa vykoná týmto spôsobom:
(a)
sérum (20 - 30 µl) sa v rovnakom objeme zmieša s antigénom na bielej doštičke alebo smaltovanej doštičke tak, aby vznikla zóna veľká asi 2 cm v priemere. Zmes sa 4 minúty jemne premieša pri teplote okolitého vzduchu a potom sa pri dobrom osvetlení pozoruje aglutinácia,
(b)
možno použiť automatickú metódu, ale táto metóda musí byť aspoň taká senzitívna a presná ako manuálna metóda.
2.5.4.
Interpretácia výsledkov
Akákoľvek viditeľná reakcia sa považuje za pozitívnu, pokiaľ nenastalo prílišné osychanie okolo krajov.
Pozitívne alebo negatívne pracovné štandardy by sa mali zaradiť do každej série testov.
2.6.
Aglutinačný test séra (SAT)
2.6.1.
Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu v slanom roztoku s fenolom [NaCl 0,85 % (m/v) a fenole pri 0,5 % (v/v)]. Nesmie sa použiť formaldehyd.
Antigény možno doručiť v koncentrovanom stave za predpokladu, že nálepka na fľaši uvádza použitie riediaceho faktora.
Do antigénovej suspenzie možno pridať EDTA až do 5 mM finálneho testovacieho roztoku na zníženie hladiny falošnej pozitivity aglutinačného testu séra. Následne sa v antigénovej suspenzii musí znovu upraviť pH 7,2.
2.6.2.
OIEISS obsahuje 1 000 medzinárodných jednotiek aglutinácie.
2.6.3.
Antigén sa pripraví bez odkazu na koncentráciu buniek, ale jeho senzitivita sa musí štandardizovať v spojení s OIEISS tak, aby antigén vyprodukoval buď 50 % aglutináciu s finálnym sérovým roztokom v pomere1/600 až 1/1000 alebo 75 % aglutináciu s finálnym sérovým roztokom v pomere 1/500 až 1/750.
Mohlo by byť tiež vhodné porovnať reakčnosť nových dávok antigénu a dávok štandardizovaných predtým s použitím panelu definovaných sér.
2.6.4.
Test sa vykoná buď v skúmavkách, alebo na mikrodoštičkách. Zmes antigénu a sérových roztokov by sa mala inkubovať 16 až 24 hodín pri teplote 37 oC.
Pre každé sérum sa musia pripraviť minimálne tri roztoky. Roztoky podozrivého séra sa musia pripraviť tak, aby sa odčítanie reakcie pri hranici pozitivity uskutočnilo na prostrednej skúmavke (alebo jamke pri metóde s použitím mikrodoštičiek).
2.6.5.
Interpretácia výsledkov:
Stupeň aglutinácie Brucella v sére sa musí vyjadriť v IU na ml.
Sérum obsahujúce 30 alebo viac IU na ml sa považuje za pozitívne.
3.1.
Kožný test na brucelózu (BST)
3.1.1.
Podmienky použitia BST
(a)
Kožný test na brucelózu sa nepoužije na účely certifikácie pre obchod v rámci spoločenstva a pri výmenách s členskými štátmi.
(b)
Kožný test na brucelózu je jedným z najšpecifickejších testov na zistenie brucelózy u nevakcínovaných zvierat, diagnóza by sa však nemala urobiť len na základe pozitívnych intradermálnych reakcií.
(c)
Hovädzí dobytok, ktorý bol testovaný s negatívnym výsledkom pri jednom zo sérologických testov uvedených v tejto prílohe a ktorý reagoval pozitívne na test BST, sa považuje za infikovaný.
(d)
Hovädzí dobytok, ktorý bol testovaný s pozitívnym výsledkom pri jednom zo sérologických testov uvedených v tejto prílohe, možno podrobiť testu BST, aby sa podporila interpretácia výsledkov sérologického testu najmä v stádach bez výskytu brucelózy alebo úradne uznaného bez brucelózy, kde nemožno vylúčiť skríženú reakciu s protilátkami voči ostatným baktériám.
3.1.2.
Test sa musí vykonať s použitím štandardizovaného a definovaného alergénneho prípravku brucelózy, ktorý neobsahuje hladký lipopolysacharidový (LPS) antigén, ktorý môže vyvolať nešpecifické zápalové reakcie alebo môže zasahovať do následných sérologických testov.
Jeden takýto prípravok je brucelín INRA pripravený z nehladkého kmeňa B. melitensis.
Požiadavky na jeho výrobu sú podrobne uvedené v oddiele B2 kapitoly 2.4.2. OIE Príručky štandardov pre diagnostické testy a vakcíny, štvrté vydanie, 2000.
3.1.3.1.
Objem 0,1 ml alergénu brucelózy sa vpichne vnútrokožne do podchvostovej riasy, kože slabiny alebo na strane krku.
3.1.3.2.
Test sa odčíta po 48 - 72 hodinách.
3.1.3.3.
Hrúbka kože na mieste vpichu sa odmerá kutimetrom pred injekciou a pri opätovnom preskúmaní.
3.1.3.4.
Interpretácia výsledkov:
Silné reakcie sú ľahko rozpoznateľné lokálnym opuchom a zatvrdnutím.
Hrúbka kože 1,5 až 2 mm sa považuje za pozitívnu reakciu na test BST.
3.2.
Kompetitívna ELISA (cELISA)
3.2.1.
Podmienky použitia cELISA
(a)
cELISA sa nepoužije na certifikačné účely pre obchod v rámci spoločenstva a pri výmenách s členskými štátmi.
(b)
cELISA preukázala, že má vyššiu špecificitu ako napríklad nepriamy test ELISA, a preto môže byť použitá na podporu interpretácie výsledkov sérologického testu.
3.2.2.
Postup testu
Test sa vykoná v súlade s predpisom uvedenom v OIE Príručke štandardov pre diagnostické testy a vakcíny, štvrté vydanie, 2000, v kapitole 2.3.1 ods. 2 písm. a).
4.
NÁRODNÉ REFERENČNÉ LABORATÓRIÁ
Národné referenčné laboratórium zodpovedá za
(a)
schválenie výsledkov validačných štúdií demonštrujúcich spoľahlivosť testovacích metód použitých v členskom štáte,
(b)
určenie maximálneho počtu vzoriek, ktoré sa majú zozbierať pri použitých ELISA súpravách,
(c)
kalibráciu štandardných sekundárnych referenčných národných štandardných sér („pracovných štandardov“) voči primárnemu medzinárodnému štandardnému séru uvedenému v odseku 2.1.,
(d)
kontroly kvality všetkých antigénov a setov ELISA súprav použitých v členskom štáte,
(e)
spoluprácu v rámci Siete národných referenčných laboratórií pre brucelózu Európskej únie.