DIAGNOSTIKA AFRICKÉHO MORU KONÍ
Reagencie pre nižšie popísaný ELISA test (enzyme-linked immunosorbent assays ) možno získať z referenčného laboratória Európskeho spoločenstva alebo z Referenčného laboratória OIE pre Africký mor koní.
1.
KOMPETITIVNÝ ELISA TEST NA ZISŤOVANIE PROTILÁTOK PROTI VÍRUSU AFRICKÉHO MORU KONÍ (AHSV) (PREDPÍSANÝ TEST).
Kompetitivný ELISA test sa používa na zisťovanie špecifických AHSV protilátok v sére Equidae každého druhu. Široké spektrum – polyklonálne imunologické sérum morčaťa proti AHSV (ďalej antisérum morčaťa) je špecifické na sérologickú skupinu a je vhodné na dôkaz všetkých známych sérotypov AHS vírusu.
Princípom testu je prerušenie reakcie medzi antigénom AHSV a antisérom morčaťa vzorkou skúšobného séra. Protilátky AHSV vo vzorke skúšobného séra si budú konkurovať s protilátkami v antisére morčaťa, čo bude mať za následok zníženie očakávaného zafarbenia (po pridaní anti-morčacích protilátok a substrátu označených enzýmom). Séra sa môžu testovať na základe jednoduchého zriedenia 1:5 (metóda kvapkovej reakcie) alebo môžu byť titrované (metóda titrácie séra) na účel poskytnutia konečných bodov zriedenia. Inhibičné hodnoty vyššie ako 50 % sa môžu považovať za pozitívne.
Tu popísaný skúšobný protokol sa používa v Regionálnom referenčnom laboratóriu pre africký mor koní v Pirbrighte, Spojené kráľovstvo.
1.1.1.1.
Pokryte ELISA platne antigénom AHVS extrahovaným z infikovaných bunkových kultúr a zriedených v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufri, pH 9,6. Inkubujte ELISA platne cez noc pri 4 oC.
1.1.1.2.
Vyprázdnite jamky a premyte platne 3 x prepláchnutím s fosfátovým pufrom fyziologického roztoku soli (PBS), pH 7,2 – 7,4 a vysušte na adsorbujúcom papieri.
1.1.2.1.
Titrujte pozitívne kontrolné séra v dvojnásobne zriedených sériách, od 1 : 5 až do 1 : 640 cez stĺpec 1 v stop pufri (PBS obsahujúce 0,05 % (v/v) Tween-20, 5,0 % (w/v) sušené odtučnené mlieko (Cadbury´s MarvelTM) a 1 % (v/v) sérum z dospelého hovädzieho dobytka), ak sa nedosiahne konečný objem 50 µl/jamka.
1.1.2.2.
Pridajte 50 µl negatívneho kontrolného séra zriedeného 1 : 50 (10 µl sérum + 40 µl stop pufra) do jamiek A a B stĺpca 2.
1.1.2.3.
Pridajte 100 µl/jamka stop pufra do jamiek C a D stĺpca 2 (blank).
1.1.2.4.
Pridajte 50 µl stop pufra do jamiek E, F, G a H stĺpca 2 (kontrola morčaťa).
1.1.3.
Metóda kvapkovej reakcie
1.1.3.1.
Pridajte každé skúšobné sérum zriedené v stop pufri v pomere 1:5 do párov jamiek stĺpcov 3 – 12 (10 µl séra + 40 µl stop pufra).
1.1.4.
Metóda titrácie séra
1.1.4.1.
Pripravte dvojnásobne zriedené série každej skúšobnej vzorky (v 1 : 5 až do 1 : 640) v stop pufri cez 8 jamiek jednotlivých stĺpcov (3 – 12).
1.1.5.
Pridajte 50 µl antiséra morčaťa, predzriedeného v stop pufri do všetkých jamiek, okrem blank jamiek ELISA platne (všetky jamky teraz majú konečný objem 100 µl).
1.1.5.1.
Inkubujte jednu hodinu pri 37 oC na orbitálnej miešačke.
1.1.5.2.
Premyte platne 3 x a vysušte ako predtým.
1.1.5.3.
Pridajte do každej jamky 50 µl králičieho anti-morčacieho konjugátu chrenovej peroxidázy (HRP) predzriedeného v stop pufri.
1.1.5.4.
Inkubujte jednu hodinu pri 37 oC na orbitálnej miešačke.
1.1.5.5.
Premyte platne 3 x a vysušte ako predtým.
1.1.6.
Chromogén
Pripravte chromogén OPD (OPD = ortho-phenyldiamín) roztok podľa pokynov výrobcu (0,4 mg/ml v sterilnej destilovanej vode) krátko pred použitím. Pridajte substrát (hygrogénperoxid = H202), aby sa získala konečná koncentrácia 0,05 % (v/v) (v pomere 1 : 2000 30 % roztoku H202). Pridajte 50 µl roztoku OPD do každej jamky a nechajte platne na laboratórnom stole pri izbovej teplote.
Zastavte reakciu pridaním 50 µl/jamka 1 M kyseliny sírovej (H2SO4).
1.1.7.
Odčítanie
Odčítajte spektrofotometricky pri 492 nm.
1.2.
Vyhodnotenie výsledkov
1.2.1.
Na základe používania softvérového balíka vytlačte hodnoty optickej denzity (OD) a percento inhibície (PI) pre tert alebo kontrolné sérum na základe strednej hodnoty zaznamenanej v štyroch kontrolných jamkách pre séra morčiat. Údaje vyjadrené ako OD a PI hodnoty sa používajú na určenie toho, či sa test vykonal v akceptovateľných limitoch. Horné kontrolné limity (UCL) a dolné kontrolné limity (LCL) na kontrolu séra morčiat sú medzi OD hodnotami 1,4 a 0,4, zvlášť. Konečný titer pre pozitívnu kontrolu na základe 50 % PI musí byť 1 : 240 (v rozpätí 1 : 120 do 1 : 480). Každá platňa, ktorá nespĺňa vyššie uvedené kritériá, musí byť zamietnutá. Ak je však sérový titer pozitívnej kontroly väčší ako 1 : 480 a skúšobné vzorky sú stále negatívne, tak potom možno akceptovať negatívne skúšobné vzorky. Párové jamky na negatívnu kontrolu séra a párové blank jamky musia zaznamenávať PI hodnoty medzi + 25 % a – 25 % a medzi + 95 % a + 105 %, zvlášť. V dôsledku chyby v rámci týchto limitov nie je platňa neplatná, ale sa predpokladá, že sa vyvíja sfarbenie pozadia.
1.2.2.
Diagnostická prahová hodnota (cut-off value) pre skúšobné séra je 50 % (PI 50 %). Vzorky, pri ktorých sa zaznamenávajú PI hodnoty väčšie ako 50 %, sa zaznamenávajú ako pozitívne. Vzorky, pri ktorých sa zaznamenávajú PI hodnoty nižšie ako 50 %, sa zaznamenávajú ako negatívne.
Vzorky, pri ktorých sú zaznamenávané PI hodnoty nad alebo pod prahovou hodnotou pre párové jamky, sa považujú za dubiózne. Také vzorky sa môžu opätovne testovať metódou kvapkovej reakcie a titráciou. Pozitívne vzorky sa môžu takisto titrovať na účel poskytnutia indikácie stupňa pozitivity.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| + vna kontr. | |
A | 1:5 | - vna kontr. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
B | 1:10 | - vna kontr. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
C | 1:20 | prázdna | | | | | | | | | | |
D | 1:40 | prázdna | | | | | | | | | | |
E | 1:80 | GP kontr. | | | | | | | | | | |
F | 1:160 | GP kontr. | | | | | | | | | | |
G | 1:320 | GP kontr. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
H | 1:640 | GP kontr. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
- vna kontr. = negatívna kontrola
+ vna kontr. = pozitívna kontrola
GP kontr. = kontrola morčaťa
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| + vna kontr. | |
A | 1:5 | - vna kontr. | 1:5 | | | | | | | | | 1:5 |
B | 1:10 | - vna kontr. | 1:10 | | | | | | | | | 1:10 |
C | 1:20 | prázdna | 1:20 | | | | | | | | | 1:20 |
D | 1:40 | prázdna | 1:40 | | | | | | | | | 1:40 |
E | 1:80 | GP kontr. | 1:80 | | | | | | | | | 1:80 |
F | 1:160 | GP kontr. | 1:160 | | | | | | | | | 1:160 |
G | 1:320 | GP kontr. | 1:320 | | | | | | | | | 1:320 |
H | 1:640 | GP kontr. | 1:640 | | | | | | | | | 1:640 |
- vna kontr. = negatívna kontrola
+ vna kontr. = pozitívna kontrola
GP kontr. = kontrola morčaťa
2.
NEPRIAMY ELISA TEST NA ZISTENIE PROTILÁTOK PROTI VÍRUSU AFRICKÉHO MORU KONÍ (AHSV) (PREDPÍSANÝ TEST).
Tu popísaný test je v súlade s popisom testu v kapitole 2.1.11 OIE Manuálu štandardov pre diagnostické testy a vakcíny, štvrté vydanie, 2000.
Používa sa rekombinantný VP7 proteín ako antigén na určenie protilátky AHS vírusu, ktorý má vysoký index citlivosti a špecifickosti. Inými výhodami je, že je stabilný, a nie je infekčný.
2.1.1.1.
ELISA platne sú pokryté rekombinantným AHSV-4 VP7, ktorý je zriedený v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufri, pH 9,6. Inkubujte ELISA platne cez noc pri 4 oC.
2.1.1.2.
Premyte platne 5 x s destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 premývací roztok). Jemne poklepte platne na absorpčný materiál, aby sa odstránil všetok zvyškový premývací roztok.
2.1.1.3.
Blokujte platne s fosfátovým pufrom fyziologického roztoku soli (PBS) + 5 % (w/v) odstredené mlieko (Nestlé sušené odtučnené mlieko (Dry Skim MilkTM), 200 µl/jamka 1 hodinu pri 37 oC.
2.1.1.4.
Odstráňte stop roztok a jemne poklepte platne na absorpčný materiál.
2.1.2.1.
Vzorky séra, ktoré sa majú testovať, a pozitívne a negatívne kontrolné séra sú zriedené v pomere 1 : 25 v PBS + 5 % (w/v) odstredené mlieko + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 µl na jamku. Inkubujte 1 hodinu pri 37 oC.
Na titrovanie urobte dvojnásobne zriedené série od 1 : 25 (100 µl/jamka), jedno sérum na každý stĺpec platne a urobte to isté s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami. Inkubujte 1 hodinu pri 37 oC.
2.1.2.2.
Premyte platne, ako je popísané v kroku 2.1.1.2.
2.1.3.1.
Rozdeľte 100 µl/jamku anti-konského gamaglobulínu konjugovaného v chrenovej peroxydáze (HRP), zriedeného v PBS + 5 % mlieka + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubujte 1 hodinu pri 37 oC.
2.1.2.3.
Premyte platne, ako je popísané v kroku 2.1.1.2.
2.1.4.1.
Pridajte 200 µl/jamku roztoku chromogén/substrátu (10 ml 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 µl H2O2).
Vývoj sfarbenia sa ukončí pridaním 50 µl 3 N H2S04 po približne 5 – 10 minútach (predtým, ako sa začne sfarbovať negatívna kontrola).
Môžu sa takisto použiť iné chromogény, ako je ABTS (2,2´-Azino-bis [3-ethylbenzothiazoline-6 kyseliny sírovej], TMB (tetramethyl benzidine) alebo OPD (ortho-phenyldiamine).
2.1.4.2.
Odčítajte platne pri 600 nm (alebo 620 nm).
2.2.
Vyhodnotenie výsledkov
2.2.1.
Vypočítajte cutt-off hodnotu pridaním 0,6 k hodnote negatívnej kontroly (0,6 je štandardná odchýlka získaná zo skupiny 30 negatívnych sér).
2.2.2.
Skúšobné vzorky s hodnotami absorbancie menšími ako limit (cutt-off) sa považujú za negatívne.
2.2.3.
Skúšobné vzorky hodnotou absorbancie väčšou ako limit cut-off + 0,15 sa považujú za pozitívne.
2.2.4.
Skúšobné vzorky so strednými hodnotami absorbancie sú dubiózne a na potvrdenie výsledku sa musí použiť druhá skúška.
3.
STOP ELISA NA ZISTENIE PROTILÁTOK PROTI VÍRUSU AFRICKÉHO MORU KONÍ (AHSV) (PREDPÍSANÝ TEST)
Stop ELISA je vypracovaný na zisťovanie špecifických AHSV protilátok v sére všetkých vnímavých druhov. VP7 je dôležitý, antigénový vírusový proteín AHSV a je konzervovaný v deviatich sérotypoch. Vzhľadom na to, že monoklonálna protilátka (Mab) je takisto namierená proti VP7, test zabezpečuje vysokú hladinu citlivosti a špecifickosti. Ďalej rekombinantný VP7 antigén je úplne neškodný a z tohto dôvodu garantuje vysoký stupeň bezpečnosti.
Princípom testu je prerušenie reakcie medzi rekombinantným VP7 ako antigénom viazaným na ELISA platňu a konjugovaným Mab špecifickým pre VP7. Protilátka v skúšobnom sére bude blokovať reakciu medzi antigénom a Mab, čo bude mať za následok zníženie farby.
Test popísaný ďalej sa vykonáva v Referenčnom laboratóriu Európskeho spoločenstva pre africký mor koní, Algete, Španielsko.
3.1.1.1.
Pokryte ELISA platne rekombinantným AHSV-4 VP7 rozriedeným v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufri, pH 9,6. Inkubujte cez noc pri 4 oC.
3.1.1.2.
Premyte platne 5 x s fosfátovým pufrom fyziologického roztoku soli (PBS), obsahujúceho 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
3.1.1.3.
Stabilizujte platne ošetrením so stabilizačným roztokom (aby sa umožnilo dlhodobé skladovanie pri + 4 oC bez straty aktivity) a vysušte na adsorbujúcom papieri.
3.1.2.
Skúšobné vzorky a kontroly
3.1.2.1.
Pre skríning: zrieďte skúšobné sérum a kontroly v pomere 1:10 priamo na platni v PBST s konečným objemom 100 µl /jamku. Inkubujte 1 hodinu pri 37 oC.
3.1.2.2.
Pre titráciu: pripravte dvojnásobne zriedené série skúšobného séra a pozitívnych kontrol (100 µl/jamku v pomere od 1 : 10 do 1 : 280 cez 8 jamiek. Negatívna kontrola sa testuje pri zriedení 1 : 10.
3.1.3.
Konjugát
Pridajte do každej jamky 50 µl Mab (monoklonálnych protilátok špecifických pre VP7) konjugovaných v predzriedenej chrenovej peroxidáze (HRP) a jemne premiešajte, aby sa zabezpečila homogenita. Inkubujte 30 minút pri 37 oC.
3.1.4.
Premyte platne 5 x s PBST a vysušte, ako je uvedené hore.
3.1.5.
Chromogén/substrát
Pridajte 100 µl/jamku roztoku chromogén/substrátu (1 ml ABTS (2,2´-Azino-bis [3-ethylbenzothiazoline-6 kyseliny sírovej]), 5 mg/ml + 9 ml substrátového pufra (0,1 M fosfátovo-citrátového pufra pH 4 obsahujúceho 0,03 % H2O2] a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote.
Rozvoj sfarbenia je ukončený pridaním 100 µl /jamku 2 % (w/v)SDS (sodium dodecyl sulfát).
3.1.6.
Odčítanie
Odčítajte pri 405 nm v odčítacom zariadení ELISA.
3.2.
Vyhodnotenie výsledkov
3.2.1.
Validácia testu
Test je platný, ak optická denzita (OD) negatívnej kontroly (NC) je vyššia ako 1,0 a OD pozitívnej kontroly (PC) je nižšia ako 0,2.
3.2.2.
Výpočet cutt-off
Pozitívny cut-off = NC – (NC – PC) x 0,3)
Negatívny cut-off = NC – (NC – PC) x 0,2)
Pričom NC je OD negatívnej kontroly a PC je OD pozitívnej kontroly.
3.2.3.
Interpretácia výsledkov
Vzorky s OD nižším ako pozitívny cut-off sa považujú ako pozitívne na AHSV protilátky.
Vzorky s OD vyšším ako negatívny cut-off sa považujú za negatívne na AHSV protilátky.
Vzorky s OD medzi týmito dvoma hodnotami sa považujú za dubiózne a zvieratá sú opätovne vzorkované po 2 až 3 týždňoch.