DIAGNOSTICKÉ METÓDY NA POTVRDENIE A DIFERENCIÁLNU DIAGNOSTIKU PSEUDOMORU HYDINY
Metódy izolácie a charakterizovanie vírusov klasického moru hydiny uvedené ďalej musia byť považované za orientačné a za minimá, ktoré treba použiť na diagnostiku nákazy.
Vírus, ktorý vyvoláva pseudomor hydiny, je prototypový vírus Paramyxoviridae. V súčasnosti je známych deväť skupín aviárnych paramyxovírusov, ktoré môžu byť sérologicky rozlíšené a ktoré sú označené PMV–1, PMV–2 až PMV–9. Všetky vírusy pseudomoru hydiny sú zaradené do skupiny PMV–1. Pre diagnostické metódy na potvrdenie pseudomoru hydiny a na diferenciálnu diagnostiku možno použiť túto definíciu:
Pseudomor hydiny je infekcia vyvolaná všetkými aviárnymi kmeňmi paramyxovírusu 1, ktoré majú u jednodňových kurčiat index intracerebrálnej patogenity (ICPI) vyšší než 0,7.
Odber a ošetrenie vzoriek
1.
Odber vzoriek
Výtery z kloaky (alebo výkaly) a tracheálne výtery od chorých vtákov; výkaly alebo obsahy čriev, zreteľne postihnuté orgány (mozog, trachea, pľúca, pečienka, slezina a iné) z čerstvých hydinových kadáverov.
2.
Ošetrenie vzoriek
Orgány a tkáne uvedené v odseku 1 môžu byť združované, ale je nutné, aby výkaly boli vyšetrené oddelene. Výtery musia byť umiestnené do dostatočného množstva roztoku s antibiotikami, aby sa zaistilo ich úplné ponorenie. Vzorky výkalov a orgánov musia byť homogenizované (pomocou uzatvoreného homogenizátora alebo paličky a trecej misky so sterilným pieskom) v médiu s antibiotikami tak, aby sa získala 10 % – 20 % suspenzia (hmotnosť/objem) v médiu. Suspenzia sa nechá stáť približne 2 hodiny pri teplote miestnosti (alebo dlhšiu dobu pri 4 oC), potom sa centrifuguje (napríklad 800 g –1 000 g po dobu 10 minút).
3.
Médium s antibiotikami
Rôzne laboratóriá používali s úspechom rôzne zloženia médií s antibiotikami; národné laboratóriá môžu poskytnúť potrebné odporúčania príslušnej krajine. Pre vzorky výkalov sú nutné vyššie koncentrácie antibiotík. Typické je nasledujúce zloženie: 10 000 jednotiek/ml penicilínu, 10 mg/ml streptomycínu, 0,25 mg/ml gentamycínu a 5 000 jednotiek/ml mycostatínu vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP). Pre tkanivá a tracheálne výtery môžu byť tieto množstvá päťkrát nižšie. Na potlačenie chlamydií je povolený prídavok 50 mg/ml oxytetracyklínu. Na prípravu média je nutné, aby bolo po pridaní antibiotík skontrolované pH a upravené medzi 7,0 a 7,4.
Izolácia vírusu z embryí slepačích vajec
Do alantoidnej dutiny najmenej 4 embryí slepačích vajec inkubovaných 8 až 10 dní sa inokuluje 0,1 až 0,2 ml číreho supernatantu. Ideálne by tieto vajcia mali pochádzať z kŕdľa bez špecifických patogénov (SPF); ak to nie je možné, pripúšťa sa používať vajcia pochádzajúce z kŕdľa, v ktorom nebol zistený výskyt protilátok proti vírusu pseudomoru hydiny. Inokulované vajcia sú inkubované pri 37 oC a sú denne presvecované. Postupne musia byť vajcia s uhynutými alebo hynúcimi embryami a všetky ostatné vajcia po 6 dňoch inokulácie schladené na 4 oC a ich alantoidná/amniová tekutina sa vyšetruje na hemaglutiníny. Ak nedôjde k hemaglutinácii, uvedený postup sa opakuje, pričom sa ako inokulum používa neriedená alantoidná/amniová tekutina.
V prípade hemaglutinácie musí byť kultiváciou vylúčená prítomnosť baktérií. Pokiaľ sú baktérie prítomné, môže sa tekutina filtrovať cez membránový ultrafilter 450 nm s dodatočným pridaním antibiotík; inokulácia kuracích embryí sa vykonáva podľa uvedeného opisu.
Diferenciálna diagnostika
1.
Predbežná diferenciácia
Všetky hemaglutinačné vírusy musia byť odoslané do národného referenčného laboratória na úplnú identifikáciu, charakterizáciu a na testy patogenity. Vzhľadom na to, že je dôležité realizovať čo najskôr protinákazové opatrenia proti pseudomoru hydiny s cieľom obmedziť šírenie vírusu, každé štátne veterinárne laboratórium by malo byť schopné identifikovať vírus pseudomoru hydiny. Hemaglutinačné tekutiny budú použité v hemaglutinačnom teste, ktorý je opísaný v ďalšom texte. Pozitívna inhibícia, t. j. 24 alebo vyššia, pomocou polyklonálnych antisér špecifických pre vírus pseudomoru hydiny s titrom minimálne 29 môže slúžiť na predbežnú identifikáciu umožňujúcu začatie dočasných opatrení tlmenia.
2.
Potvrdenie
Národné referenčné laboratórium by malo urobiť úplnú diferenciálnu diagnostiku všetkých hemaglutinačných agensov. Potvrdenie vírusu pseudomoru hydiny sa musí znovu vykonať pomocou testov inhibície hemaglutinácie s monošpecifickým kuracím sérom. Testy na stanovenie indexu intracerebrálnej patogenity podľa postupu opísaného v ďalšom texte by mali byť urobené so všetkými pozitívnymi izolátmi. Indexy patogenity vyššie než 0,7 poukazujú na prítomnosť vírusu a vyžadujú použitie kompletných opatrení tlmenia.
Na základe nových poznatkov v typizácii vírusu pseudomoru hydiny, najmä metód používajúcich monoklonálne protilátky, možno zaradiť kmene a izoláty do skupín. Existujú monoklonálne protilátky špecifické pre vakcinačné kmene, ktoré môžu byť použité v jednoduchých testoch inhibície hemaglutinácie.
Vzhľadom na to, že často môžu byť z hydinových vzoriek izolované kmene živých vakcín vyplývajú zjavné výhody, ktoré predstavuje ich rýchla identifikácia. Tieto monoklonálne protilátky môžu byť získané v referenčnom laboratóriu Európskeho spoločenstva a môžu byť dodané do národných laboratóríí.
Národné laboratóriá by mali poskytnúť všetky hemaglutinačné agensy referenčnému laboratóriu Európskeho spoločenstva.
3.
Ďalšia typizácia a charakteristika izolátov
Referenčné laboratórium Európskeho spoločenstva musí získať od národného referenčného laboratória každý hemaglutinačný vírus na doplnenie antigénnych a genetických štúdií umožňujúcich lepšie pochopiť epizootológiu choroby (alebo chorôb) vnútri Európskeho spoločenstva v rámci kompetencií a úloh referenčného laboratória Európskeho spoločenstva.
Rýchle testy na detekciu vírusu a protilátok proti pseudomoru hydiny
Rýchle testy detekcie vírusu pseudomoru hydiny u vakcinovaných vtákov a určenie protilátok u nevakcinovaných vtákov
1.
Detekcia vírusu pseudomoru hydiny
Pri diagnostike infekcií u vakcinovaných vtákov boli použité rôzne rýchle testy umožňujúce priamo detekovať antigény pseudomoru hydiny. Najbežnejšie sú používané testy s fluorescenčnými protilátkami na pozdĺžnych rezoch priedušnice a testy s protilátkami s naviazanou peroxidázou na rezoch z mozgu. Na infekcie vyvolané vírusom pseudomoru hydiny môžu byť použité aj iné priame testy na detekciu antigénu. Nevýhodou týchto testov je, že vyšetrenie všetkých potenciálnych miest replikácie vírusu pseudomoru hydiny u vakcinovaných vtákov nie je vykonateľné. Napríklad neprítomnosť dôkazu vírusu v priedušnici nevylučuje replikáciu vírusu v čreve.
2.
Detekcia protilátok u nevakcinovaných vtákov
Vo väčšine laboratórií sa na diagnostiku pseudomoru hydiny využíva hemaglutinačne inhibičný test, ktorým sa určujú titre protilátok. V ďalšom texte je tento test opísaný. Možno používať aj imunoenzymtické metódy (ELISA), ale vhodné je výsledky týchto testov kontrolovať v národnom referenčnom laboratóriu.
a)
Vzorky – V kŕdľoch, ktoré majú menej ako 20 jedincov, sa odoberajú krvné vzorky od všetkých kusov a od 20 jedincov vo väčších kŕdľoch (dáva 99 % pravdepodobnosť na odhalenie najmenej jedného pozitívneho séra, ak je 25 % zvierat alebo viac pozitívnych). Krv sa nechá zraziť a oddelí sa sérum.
b)
Vyšetrenie na protilátky – Individuálne vzorky krvných sér musia byť vyšetrené štandardným hemaglutinačne inhibičným testom opísaným v ďalšom texte. Rozdielne sú názory na vhodnosť použitia štyroch alebo ôsmich hemaglutinačných jednotiek. Použitý antigén ovplyvní hladinu, pri ktorej je sérum považované za pozitívne. Pre 4 hemaglutinačné jednotky sa za pozitívne považujú séra, pri ktorých sa titer rovná alebo je vyšší ako 24, pre 8 hemaglutinačných jednotiek sú pozitívne séra od 23.
1.
Izotonický pufrovaný fosfátový roztok (STP) (0,05M) pH medzi 7,0 a 7,4.
2.
Odoberie sa zmes červených krviniek pochádzajúcich najmenej od 3 sliepok bez špecifikovaných patogénov (ak nie sú k dispozícii, odoberie sa krv od hydiny pravidelne kontrolovanej a uznanej bez výskytu protilátok proti vírusu pseudomoru hydiny); krvinky sa dajú do rovnakého objemu Alseverovho roztoku. Pred použitím sa krvinky 3 krát premyjú v STP. Pre ďalší test sa odporúča 1 % suspenzia (hematokritová hodnota) v STP.
3.
Ako štandardný antigén sa odporúča kmeň Ulster 2C vírusu pseudomoru hydiny.
1.
Do každej jamky doštičky pre mikrometódu z plastu (s dnom v tvare V) sa aplikuje 0,025 ml STP.
2.
Do prvej jamky sa aplikuje 0,025 ml vírusovej suspenzie (t. j. alantoidnej tekutiny).
3.
Použije sa mikrozrieďovač alebo sa pripraví dvojnásobné sériové riedenie vírusu z jamky do jamky (1 : 2 až 1 : 4 096).
4.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml STP.
5.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml 1 % krviniek.
6.
Premieša sa ľahkými poklepmi a nechá sa stáť pri 4 oC.
7.
Doštičky sa posudzujú o 30 až 40 minút, ihneď, ako je dokončená kontrolná sedimentácia. Na posúdenie sa doštička nakloní, aby bolo možné pozorovať prítomnosť alebo neprítomnosť „toku“ krviniek vo forme slzy. V jamkách bez hemaglutinácie by mali krvinky prúdiť v rovnakom rytme ako v kontrolných jamkách bez vírusu.
8.
Hemaglutinačný titer zodpovedá najvyššiemu zriedeniu, ktoré vyvoláva aglutináciu krviniek. Toto zriedenie môže byť považované za zriedenie obsahujúce jednu hemaglutinačnú jednotku. Presnejšia metóda na určenie hemaglutinačného titru spočíva vo vykonaní testov HA s vírusom pochádzajúcim z úplnej stupnice počiatočného riedenia typu 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6 atď. Táto metóda sa odporúča na presnú prípravu antigénu určeného na test inhibície hemaglutinácie.
Test inhibície hemaglutinácie (HI)
1.
Pufrovaný fosfátový roztok (STP).
2.
Alantoidná tekutina obsahujúca vírus, zriedená v STP a obsahujúca 4 alebo 8 hemaglutinačných jednotiek v 0,025 ml.
3.
Kuracie 1 % červené krvinky.
4.
Kontrolné negatívne kuracie sérum.
5.
Kontrolné pozitívne sérum.
1.
Do každej jamky plastovej doštičky pre mikrometódu (jamky s dnom v tvare V) sa aplikuje 0,025 ml STP.
2.
Do prvej jamky doštičky sa aplikuje 0,025 ml séra.
3.
Na prípravu dvojnásobných zriedení séra z jamky do jamky sa používa mikrozrieďovač.
4.
Pridá sa 0,025 ml neriedenej alantoidnej tekutiny obsahujúcej 4 alebo 8 hemaglutinačných jednotiek.
5.
Premieša sa ľahkými poklepmi a doštička sa nechá minimálne 60 minút stáť pri 4 oC alebo minimálne 30 minút pri teplote miestnosti.
6.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml 1 % krviniek.
7.
Premieša sa ľahkými poklepmi a nechá sa stáť pri 4 oC.
8.
Doštičky sa posudzujú o 30 – 40 minút, ihneď, ako je ukončená sedimentácia kontrolných krviniek. Posudzuje sa naklonením doštičky, aby bolo možné pozorovať prítomnosť alebo neprítomnosť „toku“ vo forme slzy, ktorý sa pohybuje v rovnakom rytme ako v kontrolných jamkách obsahujúcich len krvinky (0,025 ml) a PBS (0,05 ml).
9.
HI titer zodpovedá najvyššiemu zriedeniu antiséra, ktoré spôsobí úplnú inhibíciu 4 alebo 8 jednotiek vírusu (do každého HI testu musí byť zaradená titrácia HA na účely potvrdenia prítomnosti požadovaného počtu hemaglutinačných jednotiek).
10.
Platnosť výsledkov závisí od získania titru nižšieho než 23 pre 4 hemaglutinačné jednotky alebo 22 pre 8 hemaglutinačných jednotiek s kontrolným negatívnym sérom a získanie titru o jedno zriedenie bezprostredne vyššie alebo bezprostredne nižšie v pomere k známemu titru kontrolného pozitívneho séra.
Index intracerebrálnej patogenity (IPIC)
1.
V sterilnom fyziologickom roztoku sa zriedi 1 : 10 infekčná, čerstvo získaná alantoidná tekutina (HA titer musí byť vyšší ako 24 – použitie antibiotík je zakázané).
2.
Intracerebrálne sa injikuje po 0,05 ml zriedeného vírusu 10 jednodňovým kurčatám (t. j. starým viac ako 24 hodín a menej ako 40 hodín po vykľuvaní); tieto kurčatá musia pochádzať z vajec kŕdľa SPF.
3.
Kurčatá sa 8 dní vyšetrujú v intervale každých 24 hodín.
4.
Pri každom pozorovaní sa každému jedincovi pridelí koeficient: 0 = normálny, 1 = chorý, 2 = uhynutý.
5.
Podľa ďalej uvedeného príkladu sa vypočíta index:
Klinické príznaky | Dni po aplikácii | Celkové skóre |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Normálne | 10 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 14 x 0 = 0 |
Choré | 0 | 6 | 10 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 x 1 = 20 |
Uhynuté | 0 | 0 | 0 | 6 | 10 | 10 | 10 | 10 | 46 x 2 = 92 |
| Spolu = 114 |
Index = priemerný výsledok pre zviera a pre pozorovanie = 112/80 = 1,4 |
Hodnotenie kapacity tvorby plakov
1.
Všeobecne sa dáva prednosť použitiu takej stupnice riedenia vírusu, aby sa získal optimálny počet plakov na doštičke. Malo by postačovať desaťnásobné riedenie v STP dosahujúce až 10-7.
2.
V Petriho miskách s priemerom 5 cm sa pripravia súvislé monovrstvy embryonálnych kuracích buniek alebo vhodných líniových buniek (napr. Madin-Darby bovinná oblička).
3.
Do každej z dvoch Petriho misiek sa pridá 0,2 ml každého zriedeného vírusu a vírus sa nechá absorbovať v pokoji 30 minút.
4.
Po trojnásobnom premytí v STP sú infikované bunky znovu prekryté vhodným médiom obsahujúcim 1 % agaru (hmotnosť/objem) a prípadne 0,01 mg/ml trypsínu. Je dôležité nepridávať do prekrývajúceho média žiadne sérum.
5.
Po 72-hodinovej inkubácii pri 37 oC by mali plaky dosiahnuť dostatočnú veľkosť. Na účely ľahšieho pozorovania sa odstráni agarová pokrývka a jednovrstevná kultúra sa zafarbí kryštalvioleťou (0,5 % hmotnosť/objem) v 25 % (objem/objem) etanolu.
6.
Ak sú inkubované v médiu, ktoré obsahuje trypsín, musia všetky vírusy vytvárať jasné plaky. Ak prekrývajúce médium neobsahuje trypsín, tvoria plaky len vírusy, ktoré sú virulentné pre kurčatá.