I.
Trichinoskopické vyšetrenie
1.1.
trichinoskop s incandescentnou žiarovkou s 50-násobným a 80- až 100-násobným zväčšením,
1.2.
tlakové sklíčko, ktoré sa skladá z dvoch sklenených platní - jedna z nich je rozdelená na rovnaké polia,
1.3.
malé zakrivené nožnice, malá pinzeta, nôž na krájanie vzoriek, malé očíslované kontajnery na oddelené uskladnenie vzoriek, kvapkadlová pipeta,
1.4.
sklenená nádoba s kyselinou octovou a sklenená nádoba s roztokom hydroxidu draselného na vyjasnenie akýchkoľvek kalcifikácií alebo na zmäkčenie vysušeného mäsa.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat,
1) odoberie sa najmenej jedna vzorka o veľkosti lieskového orecha z miesta prechodu do šľachovitej časti oboch bránicových pilierov,
2.2.
ak je dostupný len jeden bránicový pilier, odoberie sa jedna vzorka o veľkosti dvoch lieskových orechov,
2.3.
ak nie je dostupný ani jeden bráničný pilier, odoberú sa dve vzorky približne o veľkosti lieskového orecha z rebrovej časti bránice alebo zo sternálnej časti bránice, prípadne z jazyka čelustného (žuvacieho) svalu, alebo z brušných svalov; v prípade kusov mäsa sa odoberú z každého kusa tri vzorky kostrového svalstva, ktoré obsahujú málo tuku, podľa možnosti o veľkosti lieskového orecha, z rôznych miest, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.1.
ak sú dostupné oba bránicové piliere, inšpektor pre trichinely musí z každej vzorky odobratej z celého tela zvieraťa odstrihnúť sedem kúskov o veľkosti ovsenej plevy tak, aby ich bolo spolu 14,
3.2.
ak je dostupný iba jeden bránicový pilier, odoberie sa 14 kúskov z rôznych miest, podľa možnosti miesta prechodu do šľachovitej časti; tieto kúsky sa potom stlačia medzi dvoma sklenenými platňami tak, aby bolo možné cez preparát jasne čítať normálnu tlač,
3.3.
ak sú vzorky vyšetrovaného mäsa suché a staré, musia sa pred stlačením zmäkčiť v zmesi, ktorá sa skladá z jedného dielu hydroxidu draselného a z dvoch dielov vody, po dobu 10 až 20 minút,
3.4.
ak boli z celých tiel zvierat vzorky odobraté z rebrovej časti bránice alebo zo sternálnej časti bránice, zo svaloviny jazyka alebo zo žuvacieho svalu alebo z brušných svalov, potom sa odstrihne z každej vzorky 14 kúskov o veľkosti ovsenej plevy, t. j. spolu 28,
3.5.
z každej vzorky odobratej z kusov mäsa musí inšpektor pre trichinely odstrihnúť štyri kúsky o veľkosti ovsenej plevy, čo je spolu 12 kúskov,
3.6.
trichinoskopické vyšetrenie sa musí vykonať takým spôsobom, aby bol každý preparát pomaly a pozorne prehliadnutý,
3.7.
ak trichinoskopické vyšetrenie odhalí podozrivú oblasť na preparáte, ktorej pôvod sa nemôže definitívne určiť dokonca ani najväčším zväčšením trichinoskopu, musia sa tieto preparáty prekontrolovať mikroskopom,
3.8.
mikroskopické vyšetrenie sa musí vykonať takým spôsobom, aby bol každý preparát pomaly a pozorne prehliadnutý pri zväčšení 30- až 40-krát,
3.9.
ak výsledok nie je určitý, musí vyšetrenie pokračovať na ďalšom počte vzoriek a sklíčkových preparátov; ak je potrebné, pomocou väčšieho zväčšenia, kým sa nezíska požadovaná informácia,
3.10.
trichonoskopické vyšetrenie sa musí vykonávať najmenej tri minúty,
3.11.
ak ide o náhradné vzorky, ktoré boli odobraté z rebrovej časti bránice alebo zo sternálnej časti bránice, zo svaloviny jazyka alebo zo žuvacieho svalu alebo z brušných svalov, sa musí trichinoskopické vyšetrenie vykonávať najmenej šesť minút.
3.12.
minimálny čas stanovený na vyšetrenie nezahŕňa čas potrebný na odber vzorky a prípravu preparátov,
3.13.
všeobecným pravidlom je, že pracovník, ktorý vyšetruje trichinoskopiou, nemá vyšetriť viac než 840 kusov mäsa denne, výnimočne môže vyšetriť až 1050 kusov mäsa denne.
II.
Metóda umelého trávenia
1.1.
nôž na odber vzoriek,
1.2.
malé očíslované kontajnery s uzávermi na uskladnenie vzoriek, ak je potrebné na opakovanie vyšetrení,
1.4.
2- až 3-litrový sklenený lievik so stojanom, prípojná gumová hadica, svorky na stlačenie hadice,
1.5.
sitko z umelej hmoty (s priemerom približne 18 cm a s otvormi približne 1 mm),
1.7.
malá kónická skúmavka,
1.8.
podložné hodinové sklíčko,
1.10.
stereomikroskop (zväčšenie 14- až 40-krát) s vhodným svetelným zdrojom,
1.11.
tráviaca tekutina pripravená takto: 10 g pepsínu (80 E/g FIP: Féderation internationale de pharmacie), 5 ml HCl (najmenej 37 %-ná) a doplnené do jedného litra vodou z vodovodu.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat, odoberie sa vzorka o hmotnosti najmenej 20 g z bránicového piliera v mieste prechodu do šľachovitej časti,
2.2.
ak chýbajú bránicové piliere, odoberie sa vzorka o hmotnosti najmenej 20 g z rebrovej časti alebo zo sternálnej časti bránice, alebo zo svaloviny jazyka, alebo zo žuvacieho svalu, alebo z brušných svalov,
2.3.
ak ide o kúsky mäsa, odoberie sa vzorka kostrového svalstva o hmotnosti najmenej 20 g, ktorá obsahuje málo tuku, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.1.
na vyšetrenie skupinovej vzorky z 10 ošípaných sa pripraví 10 g vzorka z každej jednotlivej 20 g vzorky. Zostávajúcich 10 g sa uchová pre dodatočné vyšetrenie jednotlivej vzorky, ak to bude potrebné,
3.2.
10 vzoriek, každá o hmotnosti 10 g, sa spojí do skupinovej vzorky. Tá sa pomelie na mäsovom mlynčeku (s otvormi 2 mm) a voľne sa umiestni do sitka, ktoré je vystlané vrstvou gázy. Potom sa sitko umiestni do lievika, ktorý je spojený dlhou gumovou hadicou s malou kónickou skúmavkou. Lievik sa naplní z okraja tráviacou tekutinou, kým nie je materiál na analýzu kompletne pokrytý. Pomer materiálu na analýzu a tráviacej tekutiny musí byť približne 1 : 20 až 1 : 30,
3.3.
po 18 až 20 hodinách inkubácie pri 37 až 39 oC sa malá kónická skúmavka odpojí a odstráni. Po opatrnom odstránení supernatantu sa sediment prítomný na hrote skúmavky pozorne spláchne do misky. Potom sa vyšetrí na prítomnosť trichinel stereomikroskopom pri 20- až 40-násobnom zväčšení,
3.4.
v prípade pozitívneho alebo dubiózneho výsledku vyšetrenia skupinovej vzorky sa jednotlivo vyšetria zvyšné jednotlivé vzorky po pridaní ďalších 20 g od každej ošípanej alebo v prípade kusov mäsa, po pridaní 20 g odobratých z každého kusa podľa bodu 2.
III.
Metóda umelého trávenia skupinových vzoriek
1.1.
nôž a pinzety na odber vzoriek,
1.2.
mlynček na mäso s otvormi o priemere 2 až 3 mm,
1.3.
3-litrová Erlenmeyerova banka s gumovou alebo vatovou zátkou,
1.4.
kónický deliaci lievik s objemom 2000 ml,
1.5.
stojan so základňou v tvare A s dĺžkou približne 28 cm, s tyčou 80 cm,
1.6.
kruh o priemere približne 10 až 11 cm, ktorý možno pripevniť na stojan,
1.7.
držiak s plochými svorkami (23 x 40 mm), ktorý sa môže pripojiť k stojanu pomocou dvojitej spojovacej skrutky,
1.8.
sitko (veľkosť otvorov 177 mikrónov) s vonkajším priemerom 11 cm so sieťkovým dnom z mosadze alebo nerezu,
1.9.
lievik s vnútorným priemerom nie menej ako 12 cm,
1.10.
100 ml sklenené odmerné valce,
1.11.
stereomikroskop (zväčšenie 15- až 40-krát) s vhodným svetelným zdrojom alebo trichinoskop s horizontálnym stolíkom pre kompresor s vhodným svetelným zdrojom,
1.12.
pri použití trichinoskopu sa používa miska na stanovenie počtu lariev, ktorú možno opísať takto: miska na stanovenie počtu lariev je zhotovená z akrylových doštičiek o hrúbke 3 mm takto:
a)
dno misky má rozmer 180 x 40 mm a je rozdelené na štvorce,
b)
bočné strany majú rozmer 230 x 20 mm,
c)
čelné strany majú rozmer 40 x 20 mm; dno misky a čelné strany misky sú vložené medzi bočné strany, a tak vytvoria misku s dvoma malými rúčkami na oboch stranách; horná strana dna má byť 7 až 9 mm nad základovým rámom, ktorý je vytvorený stranami a čelami; jednotlivé časti sú zlepené lepidlom vhodným pre daný materiál,
1.13.
Petriho misky o priemere 9 mm (pri použití stereomikroskopu), na spodnej časti so štvorcami 10 x 10 mm na vyšetrovanie, ktoré sú vyznačené ostrým predmetom,
1.14.
10-litrové kontajnery, ktoré sa využívajú, ak sa používa dekontaminácia, ako metodické ošetrenie prístroja a na zvyškovú tráviacu tekutinu v prípade pozitívnych výsledkov,
1.15.
koncentrovaná kyselina chlorovodíková (37 %-ná),
1.16.
pepsín s aktivitou : 1 : 10 000 (US national formulary) čo zodpovedá 2 000 FID (Féderation Internationale de Pharmacie),
1.17.
podnosy, na ktorých možno uchovávať 50 vzoriek, každá z nich o hmotnosti 2 g,
1.18.
váhy s presnosťou 0,1 g.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat, odoberie sa vzorka o hmotnosti približne 2 g z bránicového piliera z miesta prechodu do šľachovitej časti,
2.2.
ak chýbajú bránicové piliere odoberie sa vzorka o rovnakej hmotnosti z rebrovej časti sternálnej časti bránice alebo zo svaloviny jazyka, alebo zo žuvacieho svalu, alebo z brušných svalov,
2.3.
ak ide o kusy mäsa, odoberie sa vzorka kostrového svalstva o hmotnosti približne 2 g, ktorá obsahuje málo tuku, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.
Metóda - skupinová vzorka (100 individuálnych vzoriek súčasne)
3.1.
z každej zo 100 individuálnych vzoriek získaných od ošípaných sa odoberie približne 1 g vzorky. Táto hromadná vzorka sa naraz pomelie v mäsovom mlynčeku,
3.2.
pomleté mäso sa vloží do Erlenmeyerovej banky spolu s 7 g pepsínu, približne 2 l vody z vodovodu zahriatej na 40 až 41 oC a 25 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej; zmes sa pretrepáva až do rozpustenia pepsínu,
3.3.
pH roztoku má byť okolo 1,5 až 2,
3.4.
na účely natrávenia sa Erlenmeyerova banka inkubuje pri 40 až 41 oC približne štyri hodiny. Banka sa počas inkubácie pravidelne pretrepáva najmenej dvakrát za hodinu,
3.5.
natrávený roztok sa prefiltruje cez sitko do kužeľovitého dvojlitrového deliaceho lievika a nechá odstáť v pokoji približne jednu hodinu,
3.6.
celkový objem približne 45 ml sa vypustí do odmerného valca a rozdelí do troch Petriho misiek, na dnách ktorých sú vyznačené štvorce, 15 ml do každej misky,
3.7.
každá z Petriho misiek sa starostlivo vyšetrí na prítomnosť lariev trichinel pod stereomikroskopom,
3.8.
ak sa používa miska na stanovenie počtu lariev, objem 45 ml sa rozdelí do dvoch misiek na stanovenie počtu lariev a vyšetrí sa pod trichinoskopom,
3.9.
larvy sa javia ako identifikovateľné organizmy v usadenine a často, ak je voda vlažná, možno sledovať zvinovacie a rozvinovacie pohyby “špirály„,
3.10.
natrávený roztok sa musí vyšetriť, akonáhle je hotový; za žiadnych okolností sa vyšetrenie nesmie odložiť na nasledujúci deň,
3.11.
ak je natrávený roztok nezreteľný alebo ak sa nevyšetrí do 30 minút po príprave, musí sa vyčistiť takto: konečná vzorka 45 ml sa vyleje do odmerného valca a nechá sa odstát 10 minút, potom sa odsaje 30 ml supernatantu a zvyšných 15 ml sa doplní do objemu 45 ml vodou z vodovodu; po ďalšom usadení po dobu 10 minút sa odsaje 30 ml supernatantu a zvyšných 15 ml sa naleje do Petriho misky alebo do misky na stanovenie počtu lariev; odmerný valec sa premyje 10 ml vody z vodovodu a tá sa pridá k vzorke v Petriho miske alebo v miske na stanovenie počtu lariev.
4.
Metóda - skupinová vzorka (menej ako 100 individuálnych vzoriek)
4.1.
najviac15 individuálnych vzoriek možno pridať do skupinovej vzorky pozostávajúcej zo 100 vzoriek a vyšetriť spolu s týmito vzorkami; ak sa vyšetruje viac než 15 vzoriek a menej ako 100, objem tráviacej tekutiny bude úmerne redukovaný.
5.
Ak ide o dubiózny alebo pozitívny výsledok vyšetrenia skupinovej vzorky, musí sa odobrať ďalších 20 g vzorky od každej ošípanej podľa bodu 2. 20 g vzorky z piatich ošípaných sa spojí do jednej vzorky a sa vyšetrí sa uvedenou metódou. Týmto spôsobom vyšetria vzorky 20 skupín po päť ošípaných. Ak sa v skupinovej vzorke z piatich ošípaných zistí Trichinella spp., odoberú sa ďalšie vzorky o hmotnosti 20 g od jednotlivých ošípaných zo skupiny a každá sa vyšetrí samostatne podľa uvedenej metódy.
IV.
Metóda mechanicky podporovaného trávenia skupinovej vzorky/sedimentačná technika
1.1.
nôž alebo nožničky na krájanie vzoriek,
1.2.
podnosy s 50-timi vyznačenými štvorcami, kde na každom štvorci možno uchovávať vzorku mäsa o hmotnosti približne 2 g,
1.3.
Stomacher lab blender 3500 thermo model,
1.4.
plastové vrecká vhodné pre Stomacher lab blender,
1.5.
kužeľovité deliace lieviky o objeme 2 litre vybavené najlepšie teflónovými bezpečnostnými zátkami,
1.6.
stojany, kruhy a upínače,
1.7.
sitá s veľkosťou otvorov 177 mikrónov, vonkajším priemerom 11 cm so sieťkovým dnom z nehrdzavejúcej ocele,
1.8.
lieviky s vnútorným priemerom nie menej ako12 cm na upevnenie sít,
1.9.
100 ml sklenené valce,
1.11.
kadičky s objemom 3 l,
1.12.
lyžička alebo sklenená tyčinka na miešanie tráviacej tekutiny v kadičke,
1.13.
plastová injekčná striekačka a hadička na odsávanie,
1.14.
odmerná lyžička na 6 g,
1.15.
teplomer s presnosťou 0,5 oC s rozsahom 1 až 100 oC,
1.16.
vibrátor, napr. elektrická miešačka s odstrániteľnou hlavou,
1.17.
relé, ktoré môže zapínať a vypínať v minútových intervaloch,
1.18.
trichinoskop s horizontálnym stolíkom alebo streomikroskop s vhodným zdrojom svetla,
1.19.
miska na stanovenie počtu lariev (ak sa používa trichinoskop), miska na stanovenie počtu lariev je vyrobená z 3 mm hrubých akrylových dosiek takto:
a)
dno misky má rozmer 180 x 40 mm a je rozdelené na štvorce,
b)
bočné strany majú rozmer 230 x 20 mm,
c)
čelné strany misky majú rozmer 40 x 20 mm; dno misky a čelné strany misky sú vložené medzi bočné strany a vytvoria tak dve malé rúčky na oboch stranách; horná strana dna má byť 7 až 9 mm nad základovým rámom, ktorý je vytvorený stranami a čelami. Jednotlivé časti sú zlepené lepidlom vhodným pre daný materiál,
1.20.
Petriho misky s priemerom 9 cm (pre stereomikroskop) na spodnej časti so štvorcami 10 x 10 mm na vyšetrovanie, ktoré sú vyznačené ostrým predmetom,
1.21.
17,5 %-ný roztok kyseliny chlorovodíkovej,
1.22.
pepsín, aktivita pepsínu: 1 : 10 000 (US National Formulary), ktorá zodpovedá 1 . 12 500 BP (British Pharmacopoeia) a ktorá zodpovedá 2 000 FIP (Féderation internationale de pharmacie),
1.23.
10-litrové kontajnery, ktoré sa využívajú, ak sa používa dekontaminácia, ako metodické ošetrenie prístroja a na zvyškovú tráviacu tekutinu v prípade pozitívnych výsledkov,
1.24.
váhy s presnosťou 0,1 g.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat, odoberie sa vzorka o hmotnosti približne 2 g z bránicového piliera z miesta prechodu do šľachovitej časti,
2.2.
ak chýbajú bránicové piliere, odoberie sa vzorka o rovnakej hmotnosti z rebrovej časti alebo zo sternálnej časti bránice, alebo zo žuvacieho svalu, alebo z brušných svalov, alebo z jazykového svalu,
2.3.
ak ide o kusy mäsa, odoberie sa vzorka kostrového svalstva o hmotnosti približne 2 g, ktorá obsahuje málo tuku, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.
Postup trávenia - skupinová vzorka (100 individuálnych vzoriek súčasne)
3.1.
do Stomachera lab blender 3500 sa vložia dvojité plastové vrecká a regulátor teploty sa nastaví na 40 - 41 oC,
3.2.
do vnútorného plastového vrecka sa vleje jeden a pol litra vody o teplote 32 - 35 oC a voda sa zohreje na teplotu 40 - 41 oC,
3.3.
do vody v Stomacheri sa pridá 25 ml 17,5 %-nej kyseliny chlorovodíkovej,
3.4.
potom sa pridá 100 vzoriek, každá o hmotnosti približne 1 g (pri 25 až 30 oC), ktoré boli odobraté podľa bodu 2,
3.5.
nakoniec sa pridá 6 g pepsínu. Uvedený postup pridávania sa má prísne dodržiavať, aby sa predišlo rozkladu pepsínu,
3.6.
potom sa Stomacher nechá 25 minút spracovávať obsah sáčku,
3.7.
potom sa plastové vrecko vyberie zo Stomachera a natrávený roztok sa prefiltruje cez sitko do 3-litrovej kadičky,
3.8.
plastové vrecko sa vymyje približne 100 ml vody, ktorá sa potom použije na opláchnutie sitka a nakoniec sa pridá do filtrátu v kadičke,
3.9.
k skupinovej vzorke zo 100 vzoriek možno pridať najviac 15 vzoriek a možno ich vyšetriť spolu s týmito vzorkami.
4.
Postup trávenia - skupinová vzorka (menej ako 100 individuálnych vzoriek)
4.1.
do Stomachera lab blender 3500 sa vložia dvojité plastové vrecká a regulátor teploty sa nastaví na 40 - 41 oC,
4.2.
zmiešaním jeden a pol litra vody a 25 ml 17,5 %-nej kyseliny chlorovodíkovej sa pripraví tráviaci roztok, pridá sa 6 g pepsínu a celé sa mieša pri teplote 40 až 41 oC; uvedený postup pridávania sa má prísne dodržiavať, aby sa predišlo rozkladu pepsínu,
4.3.
z tráviaceho roztoku sa odmeria objem zodpovedajúci 15 ml/g vzorky (napr. pre 30 vzoriek je potrebný objem 30 x 15 ml alebo 450 ml) a naleje sa do vnútorného plastového vrecka spolu so vzorkami, každá o hmotnosti približne 1 g (pri 25 až 30 oC), ktoré boli odobraté podľa bodu 2,
4.4.
do vonkajšieho vrecka sa naleje voda o teplote približne 41 oC, celkový objem vreciek má byť jeden a pol litra,
4.5.
potom sa Stomacher nechá 25 minút spracovávať obsah vrecka,
4.6.
potom sa plastové vrecko vyberie zo Stomachera a natrávený roztok sa prefiltruje cez sitko do 3-litrovej kadičky,
4.7.
plastové vrecko sa vymyje približne 100 ml vody, ktorá sa potom použije na opláchnutie sitka a nakoniec sa pridá do filtrátu v kadičke.
5.
Získavanie lariev sedimentáciou
5.1.
do tráviaceho roztoku sa pridá ľad (300 až 400 g ľadových vločiek, šupinového ľadu alebo rozdrveného ľadu), čím sa zvýši jeho objem na 2 litre. Tráviaci roztok sa potom mieša, až kým sa ľad nerozpustí. V prípade menších skupinových vzoriek (pozri bod 4) je potrebné zodpovedajúcim spôsobom zredukovať množstvo ľadu,
5.2.
vychladený tráviaci roztok sa prenesie do 2-litrového deliaceho lievika, ktorý je vybavený vibrátorom na zvláštnej svorke,
5.3.
sedimentácia trvá 30 minút, pričom sa lievikom prerušovane vibruje, t. j. za minútou vibrácie nasleduje jedna minúta prestávky,
5.4.
po 30 minútach sa rýchlo vypustí 60 ml vzorky sedimentu do 100 ml odmerného valca (lievik sa po použití vypláchne roztokom detergentu),
5.5.
60 ml vzorky sa nechá stáť 10 minút, potom sa odsaje supernatant a ponechá sa objem 15 ml, ktorý sa vyšetrí na prítomnosť lariev,
5.6.
na odsatie sa môže použiť jednorazová plastová injekčná striekačka. Dĺžka striekačky má byť taká, aby 15 ml zostalo v odmernom valci, keď okraj injekčnej striekačky spočíva na okraji valca,
5.7.
zvyšných 15 ml sa vyleje do misky na stanovenie počtu lariev alebo do dvoch Petriho misiek a vyšetrí sa pomocou trichinoskopu alebo stereomikroskopu,
5.8.
natrávený roztok sa má vyšetriť čo najskôr. Za žiadnych okolností sa vyšetrenie nemá odložiť na nasledujúci deň,
5.9.
ak je natrávený roztok nezreteľný alebo ak sa nevyšetrí do 30 minút po príprave, musí sa vyčistiť takto: finálna vzorka 60 ml sa vyleje do odmerného valca a nechá sa odstáť 10 minút, potom sa odsaje 45 ml supernatantu a zvyšných 15 ml sa doplní do objemu 45 ml vodou z vodovodu; po ďalšom usadení po dobu 10 minút sa odsaje 30 ml supernatantu a zvyšných 15 ml sa naleje do Petriho misky alebo do misky na stanovenie počtu lariev; odmerný valec sa premyje 10 ml vody z vodovodu a pridá sa k vzorke v Petriho miske alebo v miske na stanovenie počtu lariev.
6.
Ak nastane dubiózny alebo pozitívny výsledok vyšetrenia skupinovej vzorky, musí sa odobrať ďalších 20 g vzorky od každej ošípanej podľa bodu 2. 20 g vzorky z piatich ošípaných sa spojí do jednej vzorky, ktorá sa vyšetrí uvedenou metódou. Týmto spôsobom vyšetria vzorky 20 skupín po päť ošípaných. Ak sa v skupinovej vzorke z piatich ošípaných zistí Trichinella spp., odoberú sa ďalšie vzorky o hmotnosti 20 g od jednotlivých ošípaných zo skupiny a každá sa vyšetrí samostatne podľa uvedenej metódy.
V.
Metóda mechanicky podporovaného trávenia skupinovej vzorky/technika izolácie lariev na filtri
1.
Prístroje a chemikálie ako v metóde IV.1 a takéto dodatočné vybavenie:
1.1.
1-litrový Gelmanov lievik s držiakom na filter (priemer 45 mm),
1.2.
filtrové kotúče, ktoré sa skladajú z kruhového sita z nehrdzavejúcej ocele s otvormi 35 mikrónov (priemer kotúča má byť 45 mm ), dvoch gumových krúžkov s hrúbkou 1 mm (vonkajší priemer má byť 45 mm a vnútorný priemer má byť 38 mm); kruhové sitko, ktoré sa umiestni medzi dva gumové krúžky a pripevní sa k nim vhodným dvojzložkovým lepidlom,
1.3.
Erlenmeyerova banka s objemom 3 litre vybavená bočnou trubicou na odsávanie,
1.5.
plastové vrecká s objemom najmenej 80 ml,
1.6.
zariadenie na uzatváranie plastových vreciek,
1.7.
reniláza, aktivita 1 : 150 000 soxhletových jednotiek na gram.
2.
Odber vzoriek - pozri metódu IV. 2.
3.1.
skupinová vzorka (100 vzoriek súčasne) - pozri metódu IV. 3,
3.2.
skupinová vzorka (menej než 100 vzoriek) - pozri metódu IV. 4.
4.
Získavanie lariev filtráciou
4.1.
do tráviaceho roztoku sa pridá ľad (300 až 400 g ľadových vločiek, šupinového ľadu alebo rozdrveného ľadu), čím sa zvýši objem na 2 litre; v prípade menších skupinových vzoriek je potrebné zodpovedajúcim spôsobom zredukovať množstvo ľadu,
4.2.
tráviaci roztok sa potom mieša, až kým sa ľad neroztopí; vychladený tráviaci roztok sa nechá stáť najmenej tri minúty, aby sa larvy stočili do špirál,
4.3.
na Erlenmeyerovu banku spojenú s filtračnou pumpou sa upevní Gelmanov lievik vybavený držiakom na filter a filtračným kruhom,
4.4.
tráviaci roztok sa naleje do Gelmanovho lievika a prefiltruje sa; ku koncu filtrácie sa môže pomôcť prechodu tráviaceho roztoku cez filter filtračnou pumpou; odsávanie sa zastaví pred tým, ako filter ostane suchý, t. j. keď v lieviku ostane 2 až 5 ml kvapaliny,
4.5.
keď sa odfiltruje všetok tráviaci roztok, filračný kruh sa odstráni a umiestni do plastového vrecka s objemom 80 ml spolu s 15 až 20 ml roztoku renilázy; roztok renilázy sa pripraví pridaním 2 g renilázy do 100 ml vody z vodovodu,
4.6.
plastové vrecko sa dvakrát uzatvorí a umiestni do Stomachera medzi vnútorné a vonkajšie vrecko,
4.7.
vrecko sa nechá spracovávať v Stomacheri tri minúty, napr. pokiaľ sa pracuje s skupinovou alebo individuálnou vzorkou,
4.8.
po troch minútach sa plastové vrecko spolu s filtračným kruhom a roztokom renilázy odstráni zo Stomachera a otvorí nožničkami. Tekutý obsah sa vyleje do misky na stanovenie počtu lariev alebo do Petriho misiek; vrecko sa vymyje 5 až 10 ml vody, ktorá sa potom pridá do misky na stanovenie počtu lariev pri vyšetrovaní trichinoskopom alebo do Petriho misky pri vyšetrovaní stereomikroskopom,
4.9.
natrávené roztoky sa vyšetria ihneď, ako sú hotové. Za žiadnych okolností sa vyšetrenie nemá odložiť na nasledujúci deň.
Poznámka: Filtračný kruh sa nesmie použiť, ak nie je úplne čistý. Nečisté kruhy sa nesmú nechať vysušiť. Filtračné kruhy možno vyčistiť tak, že sa nechajú v roztoku renilázy celú noc. Pred použitím sa umyjú v čerstvom roztoku renilázy v Stomacheri.
5.
Ak nastane dubiózny alebo pozitívny výsledok vyšetrenia skupinovej vzorky, musí sa odobrať ďalších 20 g vzorky od každej ošípanej podľa bodu 2. 20 g vzorky z piatich ošípaných sa spojí do jednej vzorky, ktorá sa vyšetrí uvedenou metódou. Týmto spôsobom vyšetria vzorky 20 skupín po päť ošípaných. Ak sa v skupinovej vzorke z piatich ošípaných zistí Trichinella spp., odoberú sa ďalšie vzorky o hmotnosti 20 g od jednotlivých ošípaných zo skupiny a každá sa vyšetrí samostatne podľa uvedenej metódy.
VI.
Metóda magnetického miešania pri trávení skupinových vzoriek
1.1.
nôž a pinzety na rezanie vzoriek,
1.2.
podnosy s 50-timi vyznačenými štvorcami, kde na každom štvorci možno uchovávať vzorku mäsa o hmotnosti približne 2 g,
1.4.
magnetické miešačky s termostaticky kontrolovanou vyhrievacou platňou a miešacími tyčinkami potiahnutými teflónom o dĺžke približne 5 cm,
1.5.
kužeľovité deliace lieviky o objeme 2 l,
1.6.
stojany, kruhy, upínače,
1.7.
sitá s veľkosťou otvorov 177 mikrónov, vonkajším priemerom 11 cm so sieťkovým dnom z nehrdzavejúcej ocele,
1.8.
lieviky s vnútorným priemerom najmenej 12 cm na upevnenie sít,
1.9.
kadička s objemom 3 l,
1.10.
odmerné valce s objemom približne 50 ml alebo centrifugačné skúmavky,
1.11.
trichinoskop s horizontálnym stolíkom alebo stereomikroskop s vhodným zdrojom svetla,
1.12.
miska na stanovenie počtu lariev (ak sa používa trichinoskop), miska na stanovenie počtu lariev je vyrobená z 3 mm hrubých akrylových dosiek takto:
a)
dno misky má rozmer 180 x 40 mm a je rozdelené na štvorce,
b)
bočné strany majú rozmer 230 x 20 mm,
c)
čelné strany misky majú rozmer 40 x 20 mm; dno misky a čelné strany misky sú vložené medzi bočné strany a vytvoria tak dve malé rúčky na oboch stranách; horná strana dna má byť 7 až 9 mm nad základovým rámom, ktorý je vytvorený stranami a čelami. Jednotlivé časti sú zlepené lepidlom vhodným pre daný materiál,
1.13.
Petriho misky s priemerom 9 cm (pre streomikroskop) na spodnej časti so štvorcami 10 x 10 mm na vyšetrovanie, ktoré sú vyznačené ostrým predmetom,
1.15.
25 %-ná kyselina chlorovodíková,
1.16.
pepsín, aktivita pepsínu: 1 : 10 000 (US National Formulare), ktorá zodpovedá 1 . 12 500 BP (British Pharmacopoeia) a ktorá zodpovedá 2 000 FIP (Féderation internationale de pharmacie),
1.17.
voda z vodovodu zahriata na 46 až 48 oC,
1.18.
10-litrové kontajnery, ktoré sa využívajú, ak sa používa dekontaminácia, ako metodické ošetrenie prístroja a na zvyškovú tráviacu tekutinu v prípade pozitívnych výsledkov,
1.19.
váhy s presnosťou 0,1 g.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat, odoberie sa vzorka o hmotnosti približne 2 g z bránicového piliera z miesta prechodu do šľachovitej časti,
2.2.
ak chýbajú bránicové piliere odoberie sa vzorka o rovnakej hmotnosti z rebrovej časti alebo zo sternálnej časti bránice, alebo zo žuvacieho svalu, alebo z brušných svalov,
2.3.
ak ide o kusy mäsa, odoberie sa vzorka kostrového svalstva o hmotnosti približne 2 g, ktorá obsahuje málo tuku, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.
Metóda skupinovej vzorky (100 individuálnych vzoriek súčasne)
3.1.
z individuálnych vzoriek sa odoberie100 vzoriek, každá o hmotnosti približne 1 g podľa bodu 2 a pomelie sa na mixéri Moulinette; mlynček má byť v činnosti tri až štyrikrát, vždy približne jednu sekundu,
3.2.
rozsekané mäso sa prenesie do 3-litrovej kadičky a posype sa 10 g pepsínu; do kadičky sa vylejú 2 litre vody z vodovodu zohriatej na 46 až 48 oC spolu s 16 ml kyseliny chlorovodíkovej,
3.3.
vložka na mletie mixéra Moulinette sa opakovane ponorí do tráviaceho roztoku v kadičke, aby sa odstránilo mäso, ktoré je na nej nalepené,
3.4.
do kadičky sa vloží miešacia tyč a kadička sa pokryje hliníkovou fóliou,
3.5.
kadička sa umiestni na predhriatu platňu magnetickej miešačky a začne sa proces miešania; pred začatím miešania sa magnetická miešačka nastaví tak, aby sa počas miešania udržiavala konštantná teplota 44 až 46 oC; tráviaci roztok má počas miešania rotovať dostatočne vysokou rýchlosťou, aby sa vytvorilo hlboké vírenie bez špliechania,
3.6.
tráviaci roztok sa mieša 30 minút, potom sa miešačka vypne a tráviaci roztok sa vyleje cez sitko do sedimentačného lievika,
3.7.
tráviaci roztok sa nechá odstáť v lieviku 30 minút,
3.8.
po 30 minútach sa 40 ml vzorky z tráviaceho roztoku vypustí do odmerného valca alebo centrifugačnej skúmavky,
3.9.
40 ml vzorky sa nechá odstáť 10 minút a potom sa z nej odsaje 30 ml supernatantu, ponechá sa 10 ml objem,
3.10.
zvyšných 10 ml vzorky sedimentu sa vyleje do misky na stanovenie počtu lariev alebo Petriho misky,
3.11.
potom sa valec alebo centrifugačná skúmavka opláchne približne 10 ml vody z vodovodu, ktorá sa pridá ku vzorke v miske na stanovenie počtu lariev alebo v Petriho miske; následne sa vzorka vyšetrí trichinoskopom alebo stereomikroskopom,
3.12.
natrávený roztok sa vyšetrí ihneď, ako je hotový. Za žiadnych okolností sa vyšetrenie nemá odložiť na nasledujúci deň,
3.13.
ak sa natrávený roztok nevyšetrí do 30 minút po príprave, musí sa vyčistiť nasledovným postupom: ginálna vzorka približne 40 ml sa vyleje do odmerného valca a nechá sa odstáť 10 minút, potom sa 30 ml supernatantu odstráni a ponechá sa objem 10 ml. Tento objem sa doplní na 40 ml vodou z vodovodu; po ďalšom usadení po dobu 10 minút sa odsaje 30 ml supernatantu a ponechá sa objem 10 ml na vyšetrenie v Petriho miske alebo v miske na stanovenie počtu lariev; odmerný valec sa premyje 10 ml vody z vodovodu a pridá sa k vzorke v Petriho miske alebo v miske na stanovenie počtu lariev,
3.14.
ak sa počas vyšetrenia sediment javí nejasný, vzorka sa musí vyliať do odmerného valca a doplniť na objem 40 ml vodou z vodovodu a pokračuje sa uvedeným postupom.
4.
Metóda skupinovej vzorky (menej než 100 individuálnych vzoriek súčasne)
Ak je potrebné, pridá sa najviac 15 vzoriek, každá o hmotnosti 1 g k skupinovej vzorke, ktorá pozostáva zo 100 individuálnych vzoriek a vyšetria sa spolu s týmito vzorkami podľa bodu 3. Viac ako 15 vzoriek sa musí vyšetriť ako úplná skupinová vzorka. Pre skupinovú vzorku do 50 individuálnych vzoriek sa tráviaci roztok redukuje na 1 liter.
5.
Ak nastane pozitívny alebo dubiózny výsledok vyšetrenia skupinovej vzorky, musí sa odobrať ďalších 20 g vzorky od každej ošípanej podľa bodu 2. 20 g vzorky z piatich ošípaných sa spojí do jednej vzorky, ktorá sa vyšetrí uvedenou metódou. Týmto spôsobom vyšetria vzorky 20-tich skupín po päť ošípaných. Ak sa v skupinovej vzorke z piatich ošípaných zistí Trichinella spp., odoberú sa ďalšie vzorky o hmotnosti 20 g od jednotlivých ošípaných zo skupiny a každá sa vyšetrí samostatne podľa uvedenej metódy.
VII.
Automatická tráviaca metóda pre skupinové vzorky do 35g
1.1.
nôž a pinzety na rezanie vzoriek,
1.2.
podnosy s 50-timi vyznačenými štvorcami, kde na každom štvorci možno uchovávať vzorku mäsa o hmotnosti približne 2 g,
1.3.
homogenizátor Trichomatic 35 s filtračnou vložkou,
1.4.
roztok kyseliny chlorovodíkovej 8,5 ± 0,5 hmotnostných %,
1.5.
priesvitné polykarbónové filtre s priemerom 50 mm a veľkosťou pórov 14 mikrónov,
1.6.
pepsín, aktivita pepsínu: 1 : 10 000 (US National Formulary), ktorá zodpovedá 1. 12 500 BP (British Pharmacopoeia) a ktorá zodpovedá 2 000 FIP (Féderation internationale de pharmacie),
1.7.
váhy s presnosťou 0,1 g,
1.8.
pinzeta s plochými koncami,
1.9.
mikroskopovacie sklíčka dlhé najmenej 5 cm alebo Petriho misky o priemere najmenej 5 cm na spodnej časti so štvorcami 10 x 10 mm na vyšetrovanie, ktoré sú vyznačené ostrým predmetom,
1.10.
stereomikroskop s transmitovaným svetlom (zväčšenie 15- až 60-krát) alebo trichinoskop s horizontálnym stolíkom,
1.11.
kontajner na zhromažďovanie odpadových kvapalín,
1.12.
10-litrové kontajnery používané na dekontamináciu prístroja a pre zvyškový tráviaci roztok v prípade pozitívnych výsledkov.
2.1.
ak ide o celé telá zvierat, odoberie sa vzorka o hmotnosti približne 2 g z bránicového piliera z miesta prechodu do šľachovitej časti,
2.2.
ak chýbajú bránicové piliere, odoberie sa vzorka o rovnakej hmotnosti z rebrovej časti alebo zo sternálnej časti bránice, alebo zo žuvacieho svalu, alebo z brušných svalov,
2.3.
ak ide o kusy mäsa, odoberie sa vzorka kostrového svalstva o hmotnosti približne 2 g, ktorá obsahuje málo tuku, ak je to možné, tak z blízkosti kostí alebo šliach.
3.1.
k homogenizátoru s filtračnou vložkou sa pripojí odpadová rúrka, ktorá sa vloží do kontajnera na odpad,
3.2.
po zapnutí homogenizátora sa začne ohrev,
3.3.
pred začatím ohrevu sa otvorí a opäť zatvorí spodný ventil umiestnený pod reakčnou komorou,
3.4.
pridá sa najviac 35 vzoriek, každá o hmotnosti 1 g (pri 25 až 30 oC), ktoré boli odobraté z každej individuálnej vzorky podľa bodu 2; treba sa presvedčiť, či sa odstránili väčšie kusy šliach, pretože môžu upchať membránový filter,
3.5.
do kvapalinovej komory, ktorá je pripojená k miešaciemu zariadeniu, sa naleje voda (približne 400 ml),
3.6.
do menšej pripojenej komory na kvapalinu sa vleje približne 30 ml kyseliny chlorovodíkovej (8,5 %-nej),
3.7.
membránový filter sa umiestni pod hrubý filter v držiaku filtra s filtračnou vložkou,
3.8.
nakoniec sa pridá 7 g pepsínu; postup pridávania pepsínu sa musí prísne dodržať, aby sa predišlo rozkladu pepsínu,
3.9.
vrchnáky na reakčnej komore a komore pre kvapaliny sa uzatvoria,
3.10.
určiť čas trávenia; krátky čas trávenia (5 minút) pre vzorky z ošípaných v bežnom jatočnom veku a predĺžený čas trávenia (8 minút) pre ostatné vzorky,
3.11.
po aktivácii štartovacieho tlačidla na miešacom zariadení sa začne automatické dávkovanie a trávenie s následnou filtráciou bude automaticky pokračovať. Po 10 až 13 minútach je proces úplný a automaticky sa zastaví,
3.12.
kryt reakčnej komory sa otvorí a prekontroluje sa, či je komora prázdna; ak je v komore pena alebo zvyšky tráviaceho roztoku, zopakuje sa postup podľa bodu 7.
4.1.
držiak filtra sa rozmontuje,
4.2.
membránový filter sa vyšetrí pomocou mikroskopu alebo trichinoskopu.
5.1.
v prípade pozitívneho výsledku sa reakčná komora homogenizátora naplní do dvoch tretín vriacou vodou; voda z vodovodu sa naleje do pripojenej komory na kvapalinu, kým sa nezakryje nižší hladinový senzor, potom sa vykoná automatický čistiaci program; držiak filtra sa dekontaminuje spolu so zvyšným zariadením, napr. pôsobením formalínu,
5.2.
po dennej práci treba naplniť komoru v miešacom zariadení vodou a vykonať štandardný program.
6.
Použitie membránových filtrov
Každý polykarbonátový membránový filter sa smie použiť najviac päťkrát. Medzi každým použitím sa musí filter otočiť. Okrem toho treba filter po každom použití prekontrolovať, či nie je poškodený, pretože potom nie je vhodný na ďalšie použitie.
7.
Metóda, ktorá sa použije pri neúplnom natrávení, keď nie je možná filtrácia
Ak sa vykonáva automatický proces v homogenizátore podľa bodu 3, kryt reakčnej komory sa otvorí a prekontroluje sa, či je v komore pena alebo zvyšky roztoku. V takom prípade sa postupuje takto:
7.1.
uzavrie sa spodný ventil na reakčnej komore,
7.2.
odmontuje sa držiak filtra a membránový filter sa prenesie na podložné sklíčko alebo Petriho misku,
7.3.
do držiaka na filter sa vloží nový membránový filter a držiak filtra sa namontuje,
7.4.
komora v homogenizátore sa naplní vodou, až kým sa vodou nezakryje nižší hladinový senzor,
7.5.
vykoná sa automatický čistiaci program,
7.6.
po skončení čistiaceho programu sa otvorí vrchnák na reakčnej komore a skontrolujú sa zvyšky kvapaliny,
7.7.
ak je komora prázdna, rozmontuje sa držiak filtra a membránový filter sa prenesie pinzetou na podložné sklíčko alebo do Petriho misky,
7.8.
dva membránové filtre sa vyšetria podľa bodu 4; ak sa filtre nemôžu vyšetriť, zopakuje sa celý proces trávenia s predĺženým časom trávenia podľa bodu 3.
8.
Ak nastane pozitívny alebo dubiózny výsledok pri skupinovej vzorke, odoberie sa ďalších 20 g vzorky z každej ošípanej podľa bodu 2 a tieto sa musia vyšetriť jednotlivo podľa uvedenej metódy.